样品RNA的抽提: ①产品仅用于科研取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其*溶解。 ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其*溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定 A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 g/ml。 产品名称 | 利什曼原虫通用探针法荧光PCR检测试剂盒 | 英文名称 | Leishmania spp. | 货号 | YSP96880 |
实验过程: 一、试剂准备 1. DNA模板 2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μ Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,后在72℃ 保温7min。 3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测 三、注意事项 1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。好设立一个的PCR实验室。 2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。 3.产品仅用于科研所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 荧光定量PCR试剂盒技术: 本实用新型技术公开了一种实时荧光定量PCR试剂盒,包括盒体,盒体由上盒体和下盒体组成,上盒体的底面上设有限位凸起,下盒体的顶面上设有与限位凸起匹配的凹槽,且在下盒体左右侧壁的下端均软连接有侧盖,侧盖远离下盒体的一端连接有卡勾,下盒体的上端边缘处设有环形凸起,两个卡勾分别勾住环形凸起的左右两端将上盒体固定在下盒体上;凹槽的内部设有固定杆,固定杆上通过转动件转动连接有用于放置试管的试管架;下盒体的左右两侧均设置有收纳槽。本实用新型技术通过将盒体分为上下组合的两个部分,并将两个部分通过侧盖连接,即可保证试剂盒的便携性,同时使用试剂盒自带的试管可提高检测的效率。 客户只需提供样品和待检测基因名称即可。由我们提取RNA,设计并合成引物,完成荧光定量PCR实验以及后续数据分析,提供实验报告给您。 5-硝基吲哚(>98.0%(GC))4,8-二喹啉 甲基-硝基-吡啶 N-氧化物(>97.0%(T))4,8-二羟基喹啉 2-甲基-(>99.0%(GC))2-酰基-5-硝基吡啶 (S)-(-)-N-(5-硝基-2-吡啶基)脯氨(>99.0%(T))3,4,5,6-四-2-氨基吡啶 (S)-N-(5-硝基-2-吡啶基)基氨(>98.0%(T))3,4,5-三吡啶-2-甲酸 (S)-(-)-N-(5-硝基-2-吡啶基)氨(>98.0%(T))3,4,5-三-2-*基吡啶 铝酞菁(>98.0%(T))3,4,5-三-6-羟基吡啶-2-羧酸 酞菁铁(II)(升华提纯)(>98.0%(T))3,5,6-三吡啶-2-甲酸 酞菁(>93.0%(N))3,6-二氟吡啶-2-甲酸 颜料蓝15,酞菁蓝B3,6-二氟吡啶-2-基 颜料绿 73,6-二2-吡啶甲酰 酞菁铅(II)(>95.0%(T))3,6-DICHLOROPICOLINONITRILE 酞菁锌(>95.0%(T))氨基-5-甲氧基吡啶 酞菁铁(II)(>95.0%(T))氟-6-羟基-2-吡啶甲酸 酞菁钴(II)(>90.0%(T))甲氧基-嘧啶羧基 酸 酞菁二钠甲氧基喹啉 二酞菁锡(IV)-5-甲氧基吡啶 酞菁镁(II)(S)-1-基-1,2,3,四氢异喹啉 利什曼原虫通用探针法荧光PCR检测试剂盒卷曲螺旋结构域蛋白28B抗体MARCKS /FITC 荧光素标记丙氨酸蛋白激酶C底物Marcks抗体IgG100 ul 肿瘤/抗原74抗体MAP1A/Mtap1a /FITC 荧光素标记微管相关蛋白1A抗体IgG100 ul 卷曲螺旋结构域蛋白38抗体MAP1LC3A/FITC 荧光素标记自噬微管相关蛋白轻链3抗体IgG100 ul 7号染色体开放阅读框72抗体MAP-2/FITC 荧光素标记微管相关蛋白2抗体IgG100 ul 卷曲螺旋结构域蛋白42抗体Phospho-MAP2 (Ser136) /FITC 荧光素标记酸化微管相关蛋白2抗体IgG100 ul 卷曲螺旋结构域蛋白47抗体Phospho-MAP2 (Thr1620/1623) /FITC 荧光素标记酸化微管相关蛋白2抗体IgG100 ul 卷曲螺旋结构域蛋白43抗体ERK1/MAPK3/FITC 荧光素标记丝裂原活化蛋白激酶3抗体IgG100 ul 卷曲螺旋结构域蛋白46抗体MAPK4/FITC 荧光素标记丝裂原活化蛋白激酶4抗体IgG100 ul 卷曲螺旋结构域蛋白63抗体Phospho-MARCKS (Ser152/156) /FITC 荧光素标记酸化丙氨酸蛋白激酶C底物Marcks抗体IgG100 ul |