样品RNA的抽提: ①产品仅用于科研取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其*溶解。 ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其*溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定 A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 g/ml。 产品名称 | 异源曼氏杆菌探针法荧光PCR检测试剂盒 | 英文名称 | Mannheimia varigena | 货号 | YSP96906 |
实验过程: 一、试剂准备 1. DNA模板 2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μ Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,后在72℃ 保温7min。 3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测 三、注意事项 1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。好设立一个的PCR实验室。 2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。 3.产品仅用于科研所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 荧光定量PCR试剂盒技术: 本实用新型技术公开了一种实时荧光定量PCR试剂盒,包括盒体,盒体由上盒体和下盒体组成,上盒体的底面上设有限位凸起,下盒体的顶面上设有与限位凸起匹配的凹槽,且在下盒体左右侧壁的下端均软连接有侧盖,侧盖远离下盒体的一端连接有卡勾,下盒体的上端边缘处设有环形凸起,两个卡勾分别勾住环形凸起的左右两端将上盒体固定在下盒体上;凹槽的内部设有固定杆,固定杆上通过转动件转动连接有用于放置试管的试管架;下盒体的左右两侧均设置有收纳槽。本实用新型技术通过将盒体分为上下组合的两个部分,并将两个部分通过侧盖连接,即可保证试剂盒的便携性,同时使用试剂盒自带的试管可提高检测的效率。 客户只需提供样品和待检测基因名称即可。由我们提取RNA,设计并合成引物,完成荧光定量PCR实验以及后续数据分析,提供实验报告给您。 (2-氨基基氨基)基*氧基硅烷(>95.0%(GC))5-基吡啶甲酸 (2-氨基基氨基)基二甲氧基硅烷(>97.0%(GC)(T))3,二氧基酸 (2-氨基基)基三氧基硅烷(>96.0%(GC))2,4,5-三氟酚 氨基二氧基硅烷(>97.0%(GC)(T))2-炔基甲 *氧基[(氨基)基]硅烷(>98.0%(T))戊二酸 *基[(三氧基硅基)基]化铵(>98.0%(T))2-氟-5-氨基吡啶 *基[(*氧硅基)基]化铵 (50%于甲中)特戊酸 酸(*氧硅基)酯(含稳定剂BHT)(>93.0%(GC))吡啶基偕肟 (溴基)*氧基硅烷(>98.0%(GC))1--丁烷 基*氧硅烷(>97.0%(GC))2-吡啶基酸 基三硅烷(>97.0%(GC))5-溴-2-甲 基二甲氧硅烷(>95.0%(GC))茴香硫 (甲基)三氧基硅烷(>95.0%(GC))-2,6-二甲基吡啶 二甲基l[(2,3,4,5,6-五氟基)基]硅烷(>95.0%(GC))2,2-二氟环 2-(3,环氧环己基)基*氧基硅烷(>97.0%(GC))溴二酸二甲酯 异酸(三氧硅基)酯(>95.0%(GC))甲基磺酸 (巯基)*氧基硅烷(>96.0%(GC))(2-)甲基磺酰 巯基(二甲氧基)甲硅烷(>95.0%(GC))2,二磺酸二水合物 异源曼氏杆菌探针法荧光PCR检测试剂盒酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体NF-L/FITC 荧光素标记低分子量神经丝蛋白抗体IgG100 ul 酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体NF-L/PE 荧光素PE标记低分子量神经丝蛋白抗体IgG20 ul 尾部结构蛋白抗体NF-M/FITC 荧光素标记中分子量神经丝蛋白抗体IgG100 ug 5号染色体开放阅读框19抗体NF-κBp50/FITC 荧光素标记细胞核因子50/κ基因结合核因子50抗体IgG100 ul 9号染色体开放阅读框139抗体Phospho-NF-KappaB p105 (Ser927) /FITC 荧光素标记酸化细胞核因子p50/k基因结合核因子抗体IgG1 Kit 9号染色体开放阅读框140抗体NFKBp65/FITC 荧光素标记细胞核因子/k基因结合核因子抗体IgG100 ul 9号染色体开放阅读框142抗体NFKB p52/NF-κB2 p100/FITC 荧光素标记细胞核因子/k基因结合核因子 p52/p100抗体IgG100 ul 9号染色体开放阅读框163抗体Phospho-NF-κB2 p100 (Ser866/870)/FITC 荧光素标记细胞核因子/k基因结合核因子p100抗体IgG20 ul 9号染色体开放阅读框169抗体p-NFKBp65(Ser536)/FITC 荧光素标记酸化细胞核因子/酸化k基因结合核因子抗体IgG100 ul |