探针设计：提升特异性的核心
1. 探针长度与GC含量
长度选择：100-500bp（短于100bp易非特异性结合，长于500bp杂交效率低）。例如筛选重组质粒时，可针对插入片段设计300bp左右的探针。
GC含量：控制在40%-60%，避免连续4个以上相同碱基（如polyA/T），可通过OligoAnalyzer工具检查二级结构（茎环结构会降低杂交效率）。
杂交流程：减少背景与提升信号
1. 菌落转移与固定
转移技巧：用无菌硝酸纤维素膜（NC膜）或尼龙膜轻压平板，标记方向（如剪角），转移后立即用2×SSC浸泡1分钟（避免菌落脱落）。
固定方法：
碱变性：0.5M NaOH浸泡5分钟（裂解细菌，释放DNA）→ 中和液（1M Tris-HCl pH7.5）浸泡5分钟 → 2×SSC漂洗 → 80℃烘烤2小时（尼龙膜可UV交联，254nm照射30秒）。
2. 预杂交与杂交条件优化
预杂交液配方（以10mL为例）：
5×SSC + 0.1% SDS + 5×Denhardt’s溶液 + 100μg/mL鲑鱼精DNA（95℃变性5分钟后冰浴），37-42℃预杂交1-2小时（封闭膜上非特异性结合位点）。
杂交温度：
探针GC含量50%时，Tm=48.5+0.41×(GC%)-600/L（L为探针长度），杂交温度设为Tm-25℃（如Tm=65℃，杂交温度40℃）。
若背景高，可提高杂交温度（如+5℃）或增加SSC浓度（如6×SSC→2×SSC）。
3. 洗膜条件
严谨性洗涤：2×SSC+0.1% SDS室温洗2次（每次5分钟）→ 0.1×SSC+0.1% SDS 65℃洗2次（每次15分钟），严格控制温度和时间（温度过高会洗去特异性结合）。
信号检测：降低背景与提高灵敏度
1. 显色反应优化
系统：用抗DIG-AP（碱性磷酸酶）抗体孵育后，底物选BCIP/NBT（显色稳定，蓝色沉淀），避免强光照射（会加速底物分解），显色时间控制在10分钟-2小时（过长易出现背景）。
系统：链霉亲和素-HRP孵育后，用ECL化学发光底物（需暗室曝光，信号清晰，适合定量分析）。
2. 假阳性/假阴性排除
假阳性：杂交前用鲑鱼精DNA充分封闭膜；洗膜时提高盐浓度或温度；探针浓度不超过20ng/mL。
假阴性：确保探针标记效率（DIG标记后可通过点杂交验证）；菌落转移时避免膜干燥；杂交时间不少于16小时（低温杂交需延长至20小时）。
