1、60℃常规脱蜡至水后，将石蜡切片先后浸入二甲本苯Ⅰ，二甲本苯Ⅱ各10min。然后逐级降浓度酒精入水，每次3-5min。
2、热修复抗原：将切片置于0.01mol/LpH6.0枸橼钠缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10min后，反复1-2次，置于室温自然冷却。0.01mol/LpH6.0的PBS洗涤3次，每次5min
3、消除内源性过氧化物酶：用3%H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗涤2-3次，每次5min；
4、滴加一抗：滴加适当稀释的一抗到切片上，37℃孵育1小时左右或者4℃过夜，pH7.4的PBS洗涤3次，每次5min。一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。
5、加入广谱二抗，37℃孵育1小时，取出后PBS洗涤3次，每次5min。
6、DAB显色：取DAB显色液I及II各50微升加至入1mL的水中，配成DAB工作液，滴加到切片上，室温显色，镜下控制反应时间。若无背景出现则可继续显色。蒸馏水充分洗涤以终止反应。
7、观察显色后自来水冲，苏木目精复染1-2min，，自来水冲10min，梯度酒精脱水，二甲本苯透明，中性树胶封片，干燥，分析拍照。
