电流所作的功绝大部分都转换为热,因而引起介质温度升高,这会造成很多影响:
1、样品和缓冲离子扩散速度增加,ELISA试剂盒引起样品分离带的加宽。
2、产生对流,引起待分离物的混合。
3、如果样品对热敏感,会引起蛋白变性。
4、引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的,所以介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电泳,由此引起*部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小,电泳迁移速度增大,由于*部分的电泳速度比边缘快,所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度,可以减小生热,但会延长电泳时间,引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度,同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
4. 电渗:液体在电场中,对于固体支持介质的相对移动,称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团,如滤纸表面通常有一些羧基,琼脂可能会含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电,ELISA试剂盒吸附一些带相反电荷的离子,在电场的作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动,这种现象就是电渗。在pH值高于3时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗
方向与待分离分子电泳方向相同,则加快电泳速度;如果相反,则降低电泳速度。
5. 支持介质的筛孔:支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。
关于胶回收切胶的一点注意事项:
1. 电泳的buffer和gel都是新制的,切胶的台子清理干净,刀片洗净灭菌,总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。
2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积,可以用相对比较薄的胶来做,只要够点样即可,也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3. 关于防护,在一般有机玻璃后就足够了,戴上防护面具以保护眼睛,如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射,或者对于胶有特殊要求,例如要求不含EB,可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。
4. 按照正常程序点marker跑胶,然后切下有marker的胶,EB染色,紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知,ELISA试剂盒根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断,可以直接在marker边点少量的样,这样位置就容易确定了。