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猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒使用方法

点击次数:126 发布时间:2024/5/14
提 供 商: 上海研生生化试剂有限公司 资料大小:
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猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒

【产品名称】

商品名称:猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒

Name :Porcine Parvovirus (PPV) Probe qPCR Kit

【包装规格】50 次/盒

【产品及特点】

猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)会引起猪细小病毒病。这是一种猪繁殖

障碍病,该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡,特别是初产母猪发生死胎、畸

形胎和木乃伊胎,但母猪本身无明显的症状。猪群暴发此病时常与窝仔数减少、母

猪难产和重复配种等临床表现有关。在怀孕早期 30-50 天感染,胚胎死亡或被吸

收,使母猪不孕和不规则地反复发情,该病毒会给养猪业带来巨大的经济损失,因

此猪细小病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本公司开发猪细

小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒,它具有下列特点:

1.即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。

2.引物和探针经过优化,灵敏性高。

3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4.特异性高,引物是根据猪细小病毒 DNA 高度保守区设计,不会跟其他微生物 DNA

发生交叉反应。

5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数

量级

6.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

7.本产品只能用于科研。

【规格及成分】

成分 包装

2×Probe qPCR Magic Mix 500 μL(红盖)

荧光 PCR 专用模板稀释液 1 mL(绿盖)

超纯水 1ml(白盖)

猪细小病毒探针法 qPCR 引物-探针

混合液

150 μL(棕色盖)

猪细小病毒探针法 qPCR 阳性对照

(1×10E7 拷贝/μL)

50 μL(黄盖)

使用手册 1 份

【运输及保存】

低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。

【自备试剂】

样品 DNA。

【使用方法】

一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)

由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污

染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 本产品不

提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1.标记 6 个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。

2.用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头下同)。

3.在 6 号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分

钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头,在 5 号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充

分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头,在 4 号管中加入 5μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充

分震荡 1 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品待提取,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备

阳性对照),和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10

μL 再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为 PC。另

外用水作为 NC。

8.用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个

用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用

于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其

中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模

板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面

只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完

毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分/每管

样品管

N+2 个

PCR 阴

性对照管

标准曲线样品

管(1-6 管)

2×Probe qPCR Magic Mix 10 μL 10 μL 10 μL

猪细小病毒探针法 qPCR 引物-探针

混合液

3 μL 3 μL 3 μL

N+2 个待测 DNA 模板 7 μL - - 超纯水 - 7 μL - 第 6 步所得标准曲线样品稀释液

(1-6 号) - - 7 μL(1 号样到

1 号管,2 号样到

2 管…)

11.盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程 温度 时间

预变性 95℃ 10 min PCR 反应

(45 个循环)

95℃ 15sec 55℃ 30sec 72℃ 40sec(采集 FAM 通道的荧光信号)

四、数据处理

12.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值

为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品核酸浓度

的 log 值,再推算出其浓度。

13.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于

或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等

于 35。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则

为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复实验的 Ct 值如果大于或等于

40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。


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