猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒 【产品名称】 商品名称：猪细小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒 Name ：Porcine Parvovirus (PPV) Probe qPCR Kit 【包装规格】50 次/盒 【产品及特点】 猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)会引起猪细小病毒病。这是一种猪繁殖 障碍病，该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪发生死胎、畸 形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状。猪群暴发此病时常与窝仔数减少、母 猪难产和重复配种等临床表现有关。在怀孕早期 30-50 天感染，胚胎死亡或被吸 收，使母猪不孕和不规则地反复发情，该病毒会给养猪业带来巨大的经济损失，因 此猪细小病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本公司开发猪细 小病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下列特点： 1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。 2.引物和探针经过优化，灵敏性高。 3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。 4.特异性高，引物是根据猪细小病毒 DNA 高度保守区设计，不会跟其他微生物 DNA 发生交叉反应。 5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数 量级 6.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。 7.本产品只能用于科研。 【规格及成分】 成分 包装 2×Probe qPCR Magic Mix 500 μL（红盖） 荧光 PCR 专用模板稀释液 1 mL（绿盖） 超纯水 1ml（白盖） 猪细小病毒探针法 qPCR 引物-探针 混合液 150 μL（棕色盖） 猪细小病毒探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E7 拷贝/μL) 50 μL（黄盖） 使用手册 1 份 【运输及保存】 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。 【自备试剂】 样品 DNA。 【使用方法】 一、稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污 染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原 本产品不 提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。 1.标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。 2.用带芯枪头分别加入 45μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头下同）。 3.在 6 号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分 钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 4.换枪头，在 5 号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充 分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 5.换枪头，在 4 号管中加入 5μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充 分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。 6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 二、样品 DNA 的制备 7.如果有 N 个样品待提取，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备 阳性对照），和 NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10 μL 再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另 外用水作为 NC。 8.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。 三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行） 9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用 于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其 中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模 板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面 只以定量分析为例描述操作步骤。 10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完 毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）： 成分/每管 样品管 N+2 个 PCR 阴 性对照管 标准曲线样品 管（1-6 管） 2×Probe qPCR Magic Mix 10 μL 10 μL 10 μL 猪细小病毒探针法 qPCR 引物-探针 混合液 3 μL 3 μL 3 μL N+2 个待测 DNA 模板 7 μL - - 超纯水 - 7 μL - 第 6 步所得标准曲线样品稀释液 （1-6 号） - - 7 μL（1 号样到 1 号管，2 号样到 2 管…） 11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR： 过程 温度 时间 预变性 95℃ 10 min PCR 反应 （45 个循环） 95℃ 15sec 55℃ 30sec 72℃ 40sec（采集 FAM 通道的荧光信号） 四、数据处理 12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品核酸浓度 的 log 值，再推算出其浓度。 13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于 或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等 于 35。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则 为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
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