病猪蓝耳高致病/NADC-30S双重核酸检测试剂盒说明书
产品名称: 病猪蓝耳高致病/NADC-30S双重核酸检测试剂盒
规格: 48T/盒
分类:核酸检测试剂盒
原理是由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)断进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0 特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
产品及特点 ：
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。本产品就是为满足这一需求根据 PCR 原理开发的产品，它具有下列特点：
1. 一管式操作，用户只需要提供样品即可。
2. 根据大豆热休克蛋白基因保守区域设计引物，能专一性检测出样品中的大豆成分，但不能检测其他非大豆成分。
3. 快速，整个检测过程(按一个样品计)所需时间仅为 2.0 小时。
4. 只需要普通 PCR 仪和凝胶电泳仪，无需配置贵重仪器设备。
5. 对混合样品中大豆成分的检测下限为 0.1%，对样品中大豆成分的核酸检测下限为 1.0ng/μL。
6. 本只能用于科研，足够 50 次 40uL 体系的常规 PCR。
病猪蓝耳高致病/NADC-30S双重核酸检测试剂盒具有下列特点：
1.根据 指标的保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
2.灵敏度比常规 PCR 高 2-3 个数量级，可以达到几百拷贝/反应。
3.即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。
4.一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5.本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
规格及成分 成分
2×qPCR MagicMix 500 μL(装 A 袋)
微量核酸稀释液(荧光 PCR )1 mL(装 A 袋)
PCR 引物混合物 100 μL(装 A 袋)
基因阳性对照 50 μL(装 B 袋)
DNA 病毒裂解液(试用装) 15 次(9 mL)
使用手册 1 份
运输及保存：低温运输、-20℃保存(A 袋试剂放样品准备区、B 袋的阳性对照分开放置)，
自备试剂DNA 模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。
应用案例
样品 DNA 的制备
1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DNA 段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液(用带芯枪头，下同)。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
病猪蓝耳高致病/NADC-30S双重核酸检测试剂盒设置 qPCR 反应(20 μL 体系，在样品制备室进行)
9.在 PCR 管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后*后加)：
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX，则用水替代。
10. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行
优化)。
过程温度时间
预变性95℃1 分钟
PCR 反应95℃15 秒
(30 个循环)60℃15 秒
72℃15 秒
11. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，
吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的吸收光谱在 500 nm，发射光
谱在 530 nm。
四、数据处理
12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品
的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
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