苹果锈果类病毒（ASSVd）酶联免疫分析试剂盒实验原理： 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中苹果锈果类病毒（ASSVd）水平。用纯化的苹果锈果类病毒（ASSVd）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中苹果锈果类病毒（ASSVd）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的苹果锈果类病毒（ASSVd）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中苹果锈果类病毒（ASSVd） 的存在与否。 样本处理及要求： 1. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 2. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 3. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 4. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 苹果锈果类病毒（ASSVd）酶联免疫分析试剂盒操作步骤： 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀， 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 洗涤：操作同5。 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 结果判定： 试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10 临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15 阴性判定：样品OD值< 临界值（CUT OFF）者为苹果锈果类病毒（ASSVd）阴性 苹果锈果类病毒（ASSVd）酶联免疫分析试剂盒 阳性判定：样品OD值≥ 临界值（CUT OFF）者为苹果锈果类病毒（ASSVd）阳性 |
