根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：
1. 加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当zui终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。 2. 多种因素可引发星型反应：①非zui适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在（>12%）；⑥有机溶剂的存在。 3. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。 4. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：
①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；
②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。
5. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA存在位点的数目比较后，决定用酶量。对于超螺旋DNA，基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA，使用的酶单位活性应适当加大。
6. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。
7. 酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。
8.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。 |
