新城疫病毒（NCV）荧光定量RT-PCR检测试剂盒说明书
用途： 新城疫病毒的RT-PCR体外分型检测
检测原理：试剂盒中含有新城疫病毒基因特异性引物和探针，当样品中含有新城疫病毒时，提取新城疫病毒RNA通过逆转录和PCR反应成指数扩增，在反应过程中新城疫病毒的特异荧光探针跟靶核酸杂交, 同时被Taq酶水解, 把探针上的荧光基团和淬灭基团分开而产生荧光, 探针采用Fam荧光基团标记，从而通过其荧光增量来实时判断新城疫病毒的存在。
技术参数：1. 符合SN/T 1686-2005《新城疫病毒中强毒株检测方法：荧光RT-PCR法》的检测要求，可用于禽肉、禽类组织脏器、禽类排泄和分泌物，及其泄殖腔和咽喉拭样中新城疫病毒的检测。
2. 灵敏度：对于接种的鸡胚尿囊液，检测的zui高稀释度可达10-8～10-7，与鸡胚病毒分离方法的灵敏度接近。定量检测线性范围可达10-1010拷贝/ml。
3. 特异性：采用基因序列数据库设计，并通过系统验证，新城疫病毒RT-PCR能够检测所有已知新城疫病毒毒株。对于其它禽类感染因子，本试剂盒检测结果为阴性。
产品盒组成：（不包括新城疫病毒RNA提取试剂,用户可采用通用型病毒RNA提取试剂盒或试剂盒推荐的提取方法。）
适用仪器：ABI7500，9600系列，MJ opticon2，Bio-Rad等荧光定量PCR仪均可。
实验方法：1. 用户可采用通用型病毒RNA提取试剂盒提取新城疫病毒RNA用于检测或保存于-20℃以待检测。
2. 将RT-PCR一步法反应液置室温平衡，融化后取Taq HS酶和逆转录酶（使用前2000rpm离心10sec），按2.5U/管加入Taq HS酶，5.0U/管加入逆转录酶，即每个测试反应体系配制为： RT-PCR反应液18.5ul+0.5ul Taq HS酶+1ul逆转录酶。
3. 加入模板：若样本提取物保存在-20℃，则在使用前置室温解冻；阴、阳性对照使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入模板或阴、阳性对照各5μl，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应的样品号。
4. 循环条件设置：
荧光RT-PCR的反应参数为：
—— *阶段，反转录 50℃/30 min；
—— 第二阶段，预变性 94℃/2 min；
—— 第三阶段，94℃/5 s，60℃/40 s，40 个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸区。信号采集设为Fam荧光素。反应体系设为25μl。
结果分析：对于MJ Opticon2系列荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，扣除本底后再输入1-15之间的荧光值，进行Ct值的设置或拖动基线到合适的位置以确定ct值。
对于ABI7500，9600系列荧光PCR检测仪进行结果分析时基线的确定：取3-10或3-15个循环的荧光值，阈值设定原则为阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的zui高点，而不显示Ct值为宜。
质控标准：阴性对照无Ct值显示或Ct值为40，阳性对照的Ct值≤30.0，否则为实验失败。
结果判断：1. 检测样本Ct值≤35.0时，报告阳性。
2.检测样本Ct值>35.0且Ct值<40时，需重复检测一次，如果Ct值仍<40，但曲线有明显的对数增长特性，报告本阳性，否则报告阴性。
3.样本不显示Ct值时，报告阴性。
试剂盒使用注意事项：1. 本试剂盒仅用于体外检测等研究用途，开始使用前请仔细阅读本说明书全文。
2.实验必须严格分区操作：PCR前准备区——准备实验试剂；样本处理区——待测样本、模板处理区；检测区——PCR扩增检测。
3.所用的吸头和离心管都需要经DEPC水处理，以灭活RNA酶，75%乙醇也要用DEPC处理过的水配制。
4.试剂盒中各试剂充分融化后请短暂离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡。上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免污染仪器。
5.有关实验室管理规范请参照国家相关部门颁布的基因扩增实验室的管理规范执行。