在实验操作过程中，需特别注意以下几点以确保实验的准确性和安全性：

1. 抗体保存与解冻
抗体应严格保存于-20℃或更低温度，避免反复冻融。使用时置于冰上缓慢解冻，解冻后轻轻混匀，避免剧烈震荡导致抗体变性。分装保存可减少冻融次数，维持抗体活性。

2. 样本处理规范
细胞或组织样本需在预冷的PBS中快速清洗，防止目标蛋白降解。裂解液应含足量蛋白酶抑制剂，操作全程保持低温环境（4℃以下）。离心后取上清需避免吸入沉淀物，确保样本纯度。

3. 抗体稀释与孵育
根据预实验确定最佳稀释比例（建议1:500-1:2000），使用含1% BSA的TBST缓冲液稀释可降低非特异性结合。孵育时密封覆膜防止蒸发，摇床转速控制在60rpm以内，避免机械力破坏抗原表位。

4. 对照设置关键性
必须设立空白对照（仅二抗）、同型对照（同亚型无关抗体）及阳性对照（已知表达BMP4的细胞系）。建议增加内参（如β-actin）验证上样量一致性，异常结果需重复三次以上。

5. 显色与终止时机
化学发光法检测时，ECL工作液需现配现用。显影时间根据信号强度动态调整（通常10-120秒），强信号背景下可缩短曝光时间。酸性终止液加入后10分钟内完成扫描，避免膜干燥。

6. 废弃物处理
接触抗体的枪头、离心管等按生物危害废物处理，含抗体废液需用10%次氯酸钠溶液浸泡30分钟后再废弃。实验台面用75%乙醇擦拭消毒，避免交叉污染。