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鳃霉属通用PCR试剂盒实验反应五要素

点击次数:41 发布时间:2020-04-02
 
  鳃霉属通用PCR试剂盒反应五要素:
 
  参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
 
  引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:
 
  ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
 
  ②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
 
  ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
  ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
 
  ⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
 
  ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
 
  ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
 
  引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
 
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