步骤
1.  从冷藏室取出7 μm 的冻干切片并立刻放入冰冷的丙酮中浸泡10分钟。注，可选的固定条件依赖于所使用的抗原及一抗。常用的固定剂有甲醛、丙酮及甲醇。

2.  用PBS洗涤载片后吸干组织周围的水份，使载片干燥。小心地用PAP笔绕组织圈出轮廓。

3.  将切片用含有0.05%TitonX-100的PBS混合10%的马血清溶液在室温下封闭1小时。

4.  吸干封闭缓冲液，切片放入湿盒中与含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释的*抗室温体孵育1小时。用足量的抗体溶液*浸没切片，约150微升。提示,按照推荐方法稀释抗体。

5.  吸去*抗体并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗涤5次。

6.  切片在湿盒中与相应的第二荧光抗体AlexaFluor488/55ntibody（MolecularProbes）室温孵育1小时。二抗用含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释，比例为1：300，用足够量的二抗溶液（约150 μl）以*浸没切片。

7.  吸去二抗并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗涤2次。

8.  用150 μl 的PBS缓冲液洗涤切片3次。

9.  将切片与Hoechst 33342核染料[2 mg/ml 溶于PBS中]孵育2分钟。

10.  吸去二抗并用150 μl 的PBS缓冲液洗涤3次。

11.  让切片干后，每个切片中加约2滴的ProLongGold抗褪色试剂，盖上盖玻片。注意，要小心避免太过滑动盖玻片而损坏组织，不要造成气泡。吸去多余的试剂。

12.  避光放置在室温下几个小时或过液让切片干燥。一旦载片*变干，用干净的指甲油封住盖玻片的边沿。封片可以避光存放于-20°C几周时间。抗体