ELISA试剂盒Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制
一、 实验目的
熟练掌握Hanks、D-Hanks液等平衡盐溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。
二、实验原理
Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。本实验室一般用1：250(GRC公司)。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力zui强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。
三、仪器、试剂和材料
材料：3 000 mL锥形瓶，25 mL、50 mL试剂瓶，500 mL输液瓶，螺口盖，翻帽塞，pH试纸，孔径0.22μm的微孔滤膜。
试剂：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚红，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚红(0.1%)(配法：称酚红2 g，置于研磨器中，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加进该5.6%NaHC03溶液使zui终体积为100 mL。瓶装保存，备用)。
仪器： 抽滤泵1套，过滤器1套，高压灭菌锅，量筒，磁力搅拌器，研磨器。
四、实验步骤
(一)配制D-Hanks液
1.按表2—3—5称取D-Hanks试剂。
2.依次加入上述试剂至800 mL蒸馏水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高压灭菌，10磅10 min。
(二)配制Hanks液
1.按表2—3—5称取Hanks试剂。
2.称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天时研磨器应放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，调制成糊状。再放入4℃预冷的适量D-Hanks液中，4℃下磁力搅拌使*溶解。
3.用NaHC03干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右(胰酶作用的zui适pH值)，并加入0.02%EDTA以协助消化作用。
4.滤过除菌(方法见二、培养基的配制)，-20℃冻存。
五、注意事项
1.BSS的pH值应确定为7.2左右。
2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100 mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。
3.胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保持在4℃左右。
4.胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓度。
5.胰酶分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。
Ⅳ、传代细胞培养与观察
一、实验目的
熟练传代细胞的传代方法及操作过程。
二、实验原理
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，ELISA试剂盒注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
三、仪器、材料和试剂
仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净台
材料：培养瓶、试管、移液管、巴士德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、培养的细胞。
试剂：培养基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液。
四、实验步骤
1、入无菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒双手;
2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。 将培养用液37℃下预热。
3、超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁;
4、打开超净工作台的紫外灯照射台面20min左右，关闭紫外灯，打开风机清洁空气出去臭氧;
5、点燃酒精灯;取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6、将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7、倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去残留的就培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8、每个大培养瓶加入1ml胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
9、加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于CO2的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10、对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
五、注意事项
1、传代培养时注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。所有操作尽量靠近酒精灯火焰。每次只进行一种细胞的操作。每种细胞使用一套器材。
2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基。
Ⅴ、细胞的冻存与复苏
一、 实验目的
掌握细胞保存的方法，能独立地进行细胞的冻存与复苏操作。
二、实验原理
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到保种的作用。此外，还可以利用细胞冻存的形式购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
细胞冻存时向培养基中加入保护剂——终浓度5%-15% 的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，在细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
采用“慢冻快融"的方法能较好的保证细胞的存活。标准冷冻速度为-1~-2℃/min，当温度低于-25℃时加速，到-80℃之后直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。
三、仪器、试剂和材料
仪器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加样器、水浴锅、离心机。
材料：冻存管、细胞培养用材料、500ml烧杯、胶布、搪瓷杯、75%酒精棉球。
试剂：培养基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)或甘油、0.5%台盼篮染液、液氮。
四、实验步骤
(一)细胞冻存
1、取待冻存的细胞用胰酶消化，用培养基将细胞冲洗下来。800r/min离心5min，弃上清收集细胞。如果是悬浮培养的细胞，可直接离心收集细胞。
2、加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基，或是10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大，3*106个/ml左右，并可适量增加小牛血清浓度至20%。
3、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(注明细胞种类、时间、条件等)。
4、冻存管在4℃下存放30min，转放-20℃1.5h~2h，再转入-70℃4~12h后即可转入液氮内(-196℃)，注意进行登记。
(二)细胞复苏
1、取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。
2、从液氮中取出冻存管立即投入40℃水中迅速解冻。
3、取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。
4、离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗1次，加入3ml新鲜培养基，于小培养瓶中培养。
5、每日观察细胞生长情况，ELISA试剂盒如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满后进行传代培养。
五、注意事项
1、在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃环境中。
2、准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者信息。
小结：这里总结了动物细胞培养的从器材消毒、试剂配制、细胞的冻存复苏操作技术，希望对大家有用。
