人抑制素B（INH-B）ELISA试剂盒分析

仅供体外研究使用

预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中INH-B含量。

实验原理
人抑制素INH-B用纯化的INH-B抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的INH-B抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的INH-B呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（ OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制 
1、 酶标板：一块（96孔） 
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5 ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1,000 pg/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成1,000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 pg/ml。如配制500 pg/ml标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）1,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。
6、 检测溶液A：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A 1:100稀释（如：10 检测溶液A / 990 检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100 /孔），实际配制时应多配制  0.1-0.2ml。
7、 检测溶液B：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 
10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5张
12、使用说明书：1份

标本的采集及保存 
1、 血清：人抑制素INH-B全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。
2、 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。
3、 其它生物标本：请1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。
注：以上标本均应密封保存，4 保存应小于1周，-20 不应超过1个月，-80 不应超过2个月；标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 

操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37 溶解）；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预*样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ，余孔分别加标准品或待测样品100 ，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 温育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 温育1小时。
3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400 /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。 
4、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制） 100 ，加上覆膜，37 温育1小时。
5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6、 每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。
7、 每孔加终止溶液50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。

注：
1、 人抑制素INH-B试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2、 加样：加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、 温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。 
5、 试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10 ），以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
6、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

洗板方法
1、 手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。
2、 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性
本人抑制素INH-B试剂盒可同时检测重组或天然的人INH-B，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算
各标准品O.D.值扣除空白孔O.D.值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标）， O.D.值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert 1.3，根据样品的O.D.值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

检测范围：15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml，绘制标准曲线请取用以下浓度值：1,000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml。 

zui低检测限：3.9 pg/ml

说明 
1、 在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2、 试剂盒保存：请收到试剂盒后尽快将标准品、检测溶液A和检测溶液B保存于-20 ，其余试剂短期保存请置于4 ，长期保存则置于-20 。开封后的酶标板要密封加干燥剂后保存于-20 ，避免潮湿。
3、 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4、 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
5、 有效期：6个月。