原位杂交操作流程说明

一、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交*天：
1、 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
2、 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；
3、 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；
4、 PBS清洗3分钟；
5、 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6、 PBS清洗10分钟；
7、 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；
8、 PBS清洗2次，每次3分钟；
9、 0.2N的HCl孵育30分钟；
10、PBS清洗2次，每次3分钟；
11、0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12、PBS清洗2次，每次5分钟；
13、预杂交缓冲液孵育30分钟；
14、准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；
15、杂交；第二天
16、将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；
17、PBS清洗3分钟；
18、RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；
19、PBS清洗5分钟；
20、室温，2×SSC清洗10分钟；
21、37℃，1×SSC清洗10分钟；
22、37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
23、缓冲液A孵育10分钟；
24、缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；
25、加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液），37℃孵育3 小时；
26、缓冲液A清洗2次，每次10分钟；
27、缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
28、制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；
29、停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
30、固红，脱水以及封片进行核的复染。
二、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交*天：
1、 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
2、 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；
3、 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；
4、 PBS清洗5分钟；
5、 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6、 PBS清洗5分钟；
7、 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；
8、 PBS清洗2次，每次5分钟；
9、 0.2N的HCl孵育30分钟；
10、PBS清洗2次，每次5分钟；
11、0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12、PBS清洗5分钟；
13、预杂交缓冲液孵育30分钟；
14、准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针； 
15、杂交；第二天
16、将玻片置于SSC中以去除封片；
17、室温，2×SSC清洗10分钟；
18、37℃，1×SSC清洗10分钟；
19、37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
20、缓冲液A孵育10分钟；
21、缓冲液A孵育30分钟；
22、加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；
23、缓冲液A清洗2次，每次5分钟；
24、缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
25、制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；
26、停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
27、固红，脱水以及封片进行核的复染。