通过促细胞培养基分裂剂与细胞表面受体相互作用,在体外触发细胞的多克隆激活。根据所使用的促细胞分裂剂的不同,应答细胞可以是T淋巴细胞、B淋巴细胞,或两者同时,或者是单核细胞。细胞激活可以通过细胞增殖、细胞因子分泌、表面抗原表达和/或细胞体积的增加进行检测。例如在使用B细胞激活剂时,可以通过多克隆免疫球蛋白的分泌进行检测。
操作步骤:
(一)促细胞分裂剂制备
根据说明书将促细胞培养基分裂剂重新溶解于水或培养液中,制成储存液(如100´),保存于-20℃。
(二)促细胞分裂剂滴定
1.在培养液中稀释储存液到所需的*个浓度,通常为理论*浓度的10倍;
2.在培养基板或试管中直接将促细胞分裂剂进行浓度递减系列稀释(100 μl/孔);
3.每孔平行重复三次;
(三)细胞激活
1.分离外周血单核细胞培养基;
2.室温下用培养液300´g离心10分钟,收集并洗涤细胞;
3.计数细胞并将细胞在培养液中重新悬浮至106细胞/ml,在培养板中每孔加入100μl;
4.在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育(细胞增殖需2-3天;细胞因子测定测定6小时-2天;免疫球蛋白分泌测定需5-10天);
(四)细胞激活定量测定方法
1.培养基增殖检测方法采用MTT测定法;
2.细胞因子分泌测定或使用市售商业化试剂盒;
3.免疫球蛋白分泌测定采用ELISA检测