研生试剂-子宫内膜ER、PR检测技术
前几年国内大多采用亲和组化法和多克隆抗体的免疫组化方法测定组织中ER和PR，其结论一直存在争论。近几年也开始应单克隆抗体测定冰冻切片中的ER、PR，但应用常规的免疫组化法测定石蜡标本中ER和PR不能获得满意的结果。本研究设计不同实验条件下，在石蜡切片中ER、PR的免疫组化染色，旨在探索*的ER、PR免疫组化染色条件。
1 材料和方法
1.1 材料 获取月经周期规则，血内分泌激素测定正常的增生晚期(周期第13天)子宫前、后壁内膜各一条，立即放入10%缓冲福尔马林(pH 7.4)固定液内，24 h内行石蜡包埋。
1.2 试剂 抗ER、PR单抗，S-P试剂盒和多聚-L-赖氨酸胶(均由福州迈新生物技术开发公司提供)。
1.3 方法 (1)在清洁玻片涂上一层多聚-L-赖氨酸胶，待其自然干燥；(2)将石蜡标本4 μm厚切片，常规脱蜡；(3)加3%过氧化酶阻断剂50 μl，室温下放置10 min，用蒸馏水冲洗2次，每次3 min；(4)微波下抗原修复：将片子浸放于0.01 mol.L-1的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中置于微波炉内加热至95℃，10 min，冷却至室温，用PBS冲洗2次，每次3 min；(5)加10%正常兔血清50 μl，在室温下孵育10 min，吸去多余液体；(6)加*抗体(简称一抗，为即用性抗ER或PR的单抗)50 μl放置于4℃的冰箱中过夜，用PBS冲洗2次，每次3 min；(7)加生物素标记的第二抗体(兔抗鼠单抗)50 μl，置室温下10 min，用PBS冲洗2次，每次3 min；(8)加SP溶液50 μl，置室温下10 min，用PBS冲洗2次，每次3 min；(9)加新鲜配制的DAB 100 μl，显色1～2 min；(10)用自来水冲洗终止显色，脱水，封片。
为探索ER和PR染色的*条件设立以下对照：(1)用Elmer?s Glue涂胶对乳腺癌的石蜡标本切片8张；(2)常用10%福尔马林固定24 h以上28张(玻片号ER5、ER6、PR4、PR5)；(3)不用微波处理5张玻片号为ER3、ER4、ER6、PR3、PR5)；(4)加一抗后半小时再加第二抗体5张(玻片号为ER2、ER3、ER6、PR2、PR5)。
1.4 结果判断 把封固好的切片置于光镜下，用低倍和高倍镜观察，阳性细胞为细胞核内有棕色颗粒，根据着色深浅依次为“?”、“?”、“＋”和“-”〔2〕。
2 结果
2.1 不同涂胶对免疫组化测定的影响 应用Elmer?s Glue液涂胶的切片，经微波处理，或没有用微波处理都发生脱片或部分脱片。而用多聚-L-赖氨酸涂胶的待实验结束后全部完好无损，无脱片现象。
2.2 影响因素 不同固定液、固定时间，微波处理与否以及不同的一抗作用时间对免疫组化测定结果的影响，见表1和图1～4。
图1（玻片号ER1）用缓冲福尔马林固定液，24h内行石蜡包埋，经微波抗原修复，加一抗后4℃冰箱中过夜,ER染色呈强阳性(+++)。S-P×40
图2（玻片号ER3）不经微波处理，其它同图1，ER染色呈阴性（-）。S-P×40
图3（玻片号PR1）方法同图1，PR染色呈强阳性（+++）。S-P×40
图4（玻片号PR3）不经微波处理，其它同图1，PR染色呈弱阳性（±）。S-P×40
表1 不同条件下ER和PR免疫组化染色的结果
玻片号 切片数 固定液和
固定时间
微波处理 作用时间 染色结果
ER染色
ER1 16 1 1 1 +++
ER2 1 1 1 2 -
ER3 1 1 2 1 -
ER4 1 1 2 2 -
ER5 13 2 1 1 -
ER6 1 2 2 2 -
PR染色
PR1 16 1 1 1 ++
PR2 1 1 1 2 ++
PR3 1 1 2 1 ＋
PR4 13 2 1 1 +++
PR5 1 1 2 2 ＋
注：“1”表示实验组；“2”表示对照组
3 讨论
本实验结果显示，ER和PR定位于阳性组织和细胞核内，胞浆中无ER、PR染色，这与文献报道一致〔1，2〕。目前国内大多采用亲和组化法或抗ER、PR多抗测定石蜡标本中的ER和PR分布，它通过显示雌激素(E)或孕激素(P)间接反映ER和PR水平，测定结果与应用单抗免疫组化法不同，在胞浆和胞核内均有阳性染色，因此不能排除E或P与细胞内非受体蛋白结合的可能性，推测这些阳性细胞可能部分是E或P与细胞内非受体蛋白结合，并非活性ER、PR，甚至是E或P本身〔3〕，
笔者体会，石蜡切片上成功显示ER、PR关键是：(1)抗原保护：10%缓冲福尔马林(pH 7.4)固定液，24 h之内行石蜡包埋，优于常规的福尔马林固定液。固定时间过久，免疫组化染色结果差〔3〕；(2)抗原修复：微波的应用解决了过去一直认为ER、PR一旦经石蜡切片制作过程抗原即遭破坏，而只能在冰冻切片上进行的困难；(3)一抗作用时间：在4℃冰箱中过夜，比室温下作用30 min免疫组化染色效果明显增强，特别是ER，而PR免疫组化测定要求相对较低，可能是ER较PR不稳定，易受破坏，丢失。另外，发现石蜡切片经微波处理，并反复冲洗，易发生脱片，多聚-L-赖氨酸涂胶，较常用的Elmer?s Glue涂胶好，很少发生脱片现象。
作者应用该方法研究克罗米酚对子宫内膜ER、PR的影响获得较为满意的效果〔4〕。该技术的应用将推动生殖内分泌的研究，在临床上为乳腺癌、子宫内膜癌的治疗和预后判断提供客观的病理依据。
